文献快讯肺炎克雷伯菌ST307遗传特征及碳青霉烯类耐药机制

菌类文献_食用菌文献综述_怎么查菌株文献/

【据《抗生素》2022年11月报道】标题:同时携带blaCMY-6、blaOXA-48和截短型blaNDM-1的肺炎克雷伯菌ST307的遗传特征及碳青霉烯类耐药机制

研究背景

肺炎克雷伯菌可引起多种感染,如腹部感染、呼吸道感染和血流感染,这些感染的发病率和死亡率都很高。 碳青霉烯类抗生素通常用于治疗严重的细菌感染,被认为是对抗多重耐药革兰氏阴性杆菌的“最后一道防线”。 然而,随着抗生素的过度使用,碳青霉烯类抗生素的耐药率逐年加快。 中国耐药性监测网显示,我国耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌(CRKP)检出率高达27.5%。

众所周知,碳青霉烯酶的产生是肺炎克雷伯菌产生碳青霉烯类耐药的主要机制。 碳青霉烯酶主要包括KPC、NDM、OXA、IMP和VIM。 流行病学研究表明blaKPC是我国传播最广泛的碳青霉烯酶基因。 大约 74% 的 CRKP 携带 blaKPC,而 17% 的 CRKP 携带 blaNDM。 目前,碳青霉烯类抗生素水解能力较弱的blaOXA-48的携带率也有所增加。 ST11是国内最流行的CRKP克隆类型,与KPC密切相关,而其他CRKP克隆类型,如CG15、ST307和ST147也在全球逐渐兴起。

研究成果

ST 307 CRKP 的克隆性分析和群体结构

本研究药敏结果显示,研究菌株对氨曲南、头孢他啶、亚胺培南、美罗培南和厄他培南耐药。 5株CRKP菌株均属于ST307,脉冲场凝胶电泳(PFGE)显示它们密切相关。 核心基因组多位点序列分型(cgMLST)分析表明,这些菌株的平均核心基因等位基因分歧为6.8±3.6。 根据Shropshire等学者的研究,全球ST307种群可分为四个分支。 休斯顿的 ST307 菌株属于分支 1、3 和 4; 而全球流行的ST307属于进化枝2。因此我们从公共数据库中随机选择全球分布的ST307基因组,系统发育树将其分为2个分支。 结果显示,Houston菌株属于进化枝1,而本研究的菌株属于进化枝2,也就是在全球范围内传播的进化枝。

菌类文献_食用菌文献综述_怎么查菌株文献/

▲图1 ST307菌株群体结构分布。 最大似然估计方法使用C234作为系统发育树的参考菌株。

耐药基因

所有五个研究菌株均携带 blaCMY-6、blaNDM-1、blaOXA-48、blaSHV-106 和 blaTEM-1。 此外,其中两个菌株CHN14001和CHN24069也携带blaCTX-M-15和blaOXA-1(表1)。 然而,blaNDM-1 被 IS10 插入到氨基酸 25 处。由于位置 1 至 28 的片段被认为是信号肽,因此插入将使 blaNDM-1 失活。 基因克隆实验还表明,截短的blaNDM-1会引起碳青霉烯类敏感性。

▼表1 研究菌株临床信息、药敏信息及耐药基因

怎么查菌株文献_食用菌文献综述_菌类文献/

pNDM-1 和 pOXA-48 质粒在研究细菌物种方面的差异

由于研究菌株核心基因的遗传背景相对相似,我们试图探索研究菌株之间质粒谱的相似性。 S1-PFGE和Southern杂交表明blaNDM-1和blaOXA-48位于不同的质粒上。 含有截短的blaNDM-1的质粒(pNDM-1)的分子大小相同,而携带blaOXA-48的质粒(pOXA-48)的分子大小有显着差异,其中CHN24001和CHN24069的质粒有显着差异。小于CHN24003、CHN24025和CHN24039(图2A)。

菌类文献_食用菌文献综述_怎么查菌株文献/

▲图2(A)CHN24001、CHN24003、CHN24025、CHN24039和CHN24069菌株的blaNDM-1和blaOXA-48的Southern杂交。 (B) 所研究菌株的 pNDM-1 和 pOXA-48 质粒序列的比较。 (C) 菌株 CHN24001 和 CHN24025 的 pOXA-48 质粒的比较。

为了了解质粒结构,我们使用了长读长全基因组测序。 测序结果显示,pNDM-1为IncA/C2质粒(149,808 bp),携带bleMBL、rmtC、sul1、blaCMY-6和截短的blaNDM-1。 虽然 pOXA-48 是一种 IncL/M 质粒(62,546 bp),但 blaOXA-48 中只有一个耐药基因(图 2B)。 质粒序列比对表明,IS1SD介导的插入事件使得菌株CHN24003、CHN24025和CHN24039的pOXA-48质粒大于CHN24001和CNH24069的pOXA-48质粒(图2C)。

接合实验和基因克隆实验

我们使用接合实验来比较质粒的增殖和转移能力。 接合实验表明pOXA-48质粒和pNDM-1质粒可以在不同细菌中传播。 药物敏感性结果显示,pOXA-48 和 pNDM-1 质粒缀合物均对厄他培南耐药,即使 pNDM-1 质粒上的 blaNDM-1 被截短(表 2)。

▼表2 受精卵及基因克隆株药敏结果

食用菌文献综述_菌类文献_怎么查菌株文献/

我们进一步研究了pNDM-1缀合物的碳青霉烯类耐药机制。 我们关注pNDM-1质粒上的另一个耐药基因blaCMY-6,并将其克隆到大肠杆菌DH5α中。 结果显示,blaCMY-6可使厄他培南的MIC增加64倍以上,还可使亚胺培南和美罗培南的MIC增加约4-8倍(表2)。

综上所述

分离并检测到一个新的多重耐药克隆ST307,均携带blaCMY-6、blaOXA-48和截短的blaNDM-1。 blaCMY-6和blaNDM-1位于IncA/C2质粒中,而blaOXA-48位于IncL/M质粒中。 NDM-1 在信号肽处被 IS10 截短,导致碳青霉烯酶失活。 位于同一质粒上的blaCMY-6基因可以表现出碳青霉烯类抗性。

浙江大学医学院附属逸夫医院博士后石秋成和博士研究生韩新红为该文章的共同第一作者。 浙江大学医学院附属逸夫医院杜小星教授和于云松教授为本文的共同通讯作者。 同时,本研究还得到了姜岩副研究员的指导。 该研究得到了国家自然科学基金委的资助。